GB 5413.9-2010 婴幼儿食品和乳品中维生素A、D、E检测标准

　　1.范围
　　本标准规定了婴幼儿食品和乳品中维生素A、D、E的测定方法。
　　本标准适用于婴幼儿食品和乳品中维生素A、D、E的测定。
　　2.规范性引用文件
　　本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件,其*新版本(包括所有的修改单)适用于本标准。
　　3.原理
　　试样皂化后,经石油醚萃取,维生素A、E用反相色谱法分离,外标法定量;维生素D用正相色谱法净化后,反相色谱法分离,外标法定量。
　　4.试剂和材料
　　除非另有规定,本方法所用试剂均为分析纯或以上规格,水为GB/T 6682规定的一级水。
　　4.1 α-淀粉酶:酶活力≥1.5U/mg。
　　4.2 无水硫酸钠。
　　4.3 异丙醇:色谱纯。
　　4.4 乙醇:色谱纯。
　　4.5 氢氧化钾水溶液:称取固体氢氧化钾250g,加入200mL水溶解。
　　4.6 石油醚:沸程30℃～60℃。
　　4.7 甲醇:色谱纯。
　　4.8 正己烷:色谱纯。
　　4.9 环己烷:色谱纯。
　　4.10 维生素C的乙醇溶液(15g/L)。
　　4.11 维生素A、D、E标准溶液
　　4.11.1 维生素A标准储备液(视黄醇)(100μg/mL):*称取10mg的维生素A标准品,用乙醇(4.4)溶解并定容于100mL棕色容量瓶中。
　　4.11.2 维生素E标准储备液(α-生育酚)(500μg/mL):*称取50mg的维生素E标准品,用乙醇(4.4)溶解并定容于100mL棕色容量瓶中。
　　4.11.3 维生素D2标准储备液(100μg/mL):*称取10mg的维生素D2标准品,用乙醇(4.4)溶解并定容100mL棕色容量瓶中。
　　4.11.4 维生素D标准储备液(l00μg/mL):*称取10mg的维生素D3标准品,用乙醇(4.4)溶解并定容于100mL棕色容量瓶中。
　　注:维生素A、D、E标准储备液均须-l0℃以下避光储存。标准工作液临用前配制。标准储备溶液用前需校正,见附录A
　　5.仪器和设备
　　5.1 高效液相色谱仪,带紫外检测器。
　　5.2 旋转蒸发器。
　　5.3 恒温磁力搅拌器:20℃～80℃。
　　5.4 氮吹仪。
　　5.5 离心机:转速≥5000转/分钟。
　　5.6 培养箱:60℃±2℃。
　　5.7 天平:感量为0.1mg。
　　6.分析步骤
　　6.1 试样处理
　　6.1.1 含淀粉的试样
　　称取混合均匀的固体试样约5g或液体试样约50g(*到0.1mg)于250mL三角瓶中,加入lg α-淀粉酶(4.1),固体试样需用约50mL 45℃～50℃的水使其溶解,混合均匀后充氮,盖上瓶塞,置于60℃±2℃培养箱(5.6)内培养30min。
　　6.1.2 不含淀粉的试样
　　称取混合均匀的固体试样约10g或液体试样约50g(*到0.1mg)于250mL三角瓶中,固体试样需用约50mL 45℃～50℃水使其溶解,混合均匀。
　　6.2 测定维生素D的试样需要同时做回收率实验。
　　6.3 待测液的制备
　　6.3.1 皂化:于上述处理的试样溶液中加入约100mL维生素C的乙醇溶液(4.10),充分混匀后加25mL氢氧化钾水溶液(4.5)混匀,放入磁力搅拌棒,充氮排出空气,盖上胶塞。1000mL的烧杯中加入约300mL的水,将烧杯放在恒温磁力搅拌器(5.3)上,当水温控制在53℃±2℃时,将三角瓶放入烧杯中,磁力搅拌皂化约45min后,取出立刻冷却到室温。
　　6.3.2 提取:用少量的水将皂化液全部转入500mL分液漏斗中,加入100mL石油醚(4.6),轻轻摇动,排气后盖好瓶塞,室温下振荡约10min后静置分层,将水相转入另一500mL分液漏斗中,按上述方法进行第二次萃取。合并醚液,用水洗至近中性。醚液通过无水硫酸钠过滤脱水,滤液收入500mL圆底烧瓶中，于旋转蒸发器上在40℃±2℃充氮条件下蒸至近干（绝不允许蒸干）。残渣用石油醚转移至10mL容量瓶中，定容。