SN/T 0169-2010 进出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检测标准

　　1 范围
　　本标准规定了进出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检测方法。
　　本标准中MPN法适用于进出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验；平板计数法适用于进出口食品中大肠菌群的检验；β葡萄糖苷酶荧光法适用于进出口食品(不包括贝类)中大肠杆菌的检验；滤膜/MUG法适用于进出口方便面、膨化食品、矿泉水、饮料、牛奶(需用蛋白酶处理)、单晶糖和椒粒中大肠菌群和大肠杆菌的检验。
　　2 规范性引用文件
　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其*新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
　　SN/T 1538.1 培养基制备指南 第1部分：实验室培养基制备质量保证通则
　　SN/T 1538.2 培养基制备指南第2部分：培养基性能测试实用指南
　　3 术语和定义
　　下列术语和定义适用于本文件。
　　3.1 大肠菌群 coliform
　　需氧及兼性厌氧，能在37℃48h分解乳糖产酸产气的一群革兰氏阴性无芽孢杆菌。
　　3.2 粪大肠菌群 fecal coliform
　　需氧及兼性厌氧，能在44.5℃±0.5℃，24h发酵乳糖产酸产气的一群革兰氏阴性无芽孢杆菌，该菌又可称耐热大肠菌群( thermotolerant coliform organisms)。
　　3.3 大肠杆菌 Escherichia coli
　　需氧及兼性厌氧，能在44.5℃±0.5℃48h分解乳糖产酸产气，生化特征“ IMViC”为“++—或+——”的一群革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌又可称大肠埃希氏菌。
　　4 检验方法
　　4.1 原理
　　4.1.1 *可能近似值(most probable number，MPN)法
　　MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后，根据其未生长的*低稀释度与生长的*髙稀释度，应用统计学概率论推算岀大肠菌群、粪大肠菌群或大肠杄菌在
　　待测样品中的*大可能数。
　　4.1.2 平板计数法
　　大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸，在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色，带有或不带有沉淀环的菌落。
　　4.1.3 β-葡萄糖苷酶荧光法
　　大肠杆菌中的β-葡萄糖苷酶可降解培养基中4-甲基伞形酮β-D葡萄糖苷酸(MUG)，并释放4-甲基伞形酮荧光物质(4-MU)，该物质在紫外灯(波长366nm)下会显现蓝色荧光特点。
　　4.1.4 滤膜/MUG法
　　待测样品通过滤膜过滤时，样品中的大肠菌群和大肠杆菌被截留于滤膜表面。将滤膜贴附于LMG或BMA琼脂上培养后，大肠菌群在ⅠMG琼脂上会形成蓝色菌落;而BMA琼脂上的大肠杄菌由于葡萄糖苷降解4-甲基伞形酮β-D葡萄糖苷酸(MUG)并释放4-甲基伞形酮，形成紫外光(366nm)下为蓝白色荧光的菌落。
　　4.2 培养基与试剂
　　4.2.1 生理盐水：见附录A.1
　　4.2.2 Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液：见附录A.2。
　　4.2.3 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(LST)：见附录A.3
　　4.2.4 煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)：见附录A.4。
　　4.2.5 大肠杆菌肉汤(EC)：见附录第A.5。
　　4.2.6 伊红美蓝琼脂(EMB)：见附录A.6
　　4.2.7 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)：见附录A.7
　　4.2.8 月桂基硫酸盐胰蛋白胨MUG肉汤(LST-MUG)：见附录A.8
　　4.2.9 Columbia-MUG：见附录A.9。
　　4.2.10 蛋白胨-吐温80稀释液(PT)：见附录A.10
　　4.2.11 乳糖莫能菌素葡萄糖酸琼脂(LMG)：见附录A.11。
　　4.2.12 缓冲MUG琼脂(BMA)：见附录A.12。
　　4.2.13 三(羟甲基)胺甲烷(Tris)缓冲剂：见附录A.13
　　4.2.14 营养琼脂斜面：见附录A.14
　　4.2.15 色氨酸肉汤：见附录A.15。
　　4.2.16 MR-VP培养基：见附录A.16。
　　4.2.17 Korser氏枸椽酸盐肉汤：见附录A.17。
　　4.2.18 Kovacs氏靛基质试剂：见附录A.18。
　　4.2.19 甲基红指示剂：见附录A.19
　　4.2.20 VP试剂(VP)：见附录A.20。
　　4.2.21 革兰氏染色液：见附录A.21。
　　4.2.22 胰蛋白酶贮存液：见附录A.22。
　　4.3 设备与材料
　　4.3.1 培养箱：36℃±1℃，44.5℃±0.5℃。
　　4.3.2 水浴箱：36℃±1℃，44.5℃±0.5℃。
　　4.3.3 冰箱：0℃~5℃和-15℃~-20℃。
　　4.3.4 均质器：涡旋式或拍击式。
　　4.3.5 吸管：1mL，具0.1mL刻度;5mL和10mL，具1mL刻度
　　4.3.6 平皿：直径90mm。
　　4.3.7 试管：16mm×160mm。
　　4.3.8 稀释瓶：三角烧瓶、广口瓶或其他适宜的容器。
　　4.3.9 玻璃小倒管：长度约20mm。
　　4.3.10 天平：感量0.1g。
　　4.3.11 显微镜。
　　4.3.12 菌落计数器。
　　4.3.13 滤器：备预滤器。
　　4.3.14 滤膜：有机或水相，孔径0.45μm。
　　4.3.15 真空泵。
　　4.3.16 紫外灯：波长366nm。
　　4.4 样品制备
　　4.4.1 固体或半固体样品
　　无菌操作称取样品25g置于装有225mL灭菌稀释剂(4.2.1/4.2.2)的适宜容器中，充分振摇、混匀。或将剪碎后的试样25g置于灭菌的均质杯/袋内，加亼225mL灭菌稀释剂，以8000r/min~l0000r/min涡旋式均质lmin，或以6次/s~9次/s拍击式均质lmin，制成1：10的样品稀释液备用。
　　4.4.2 液体样品
　　以无菌吸管吸取样品25mL置于装有225mL灭菌稀释剂的适宜容器中，以30cm幅度于7s内振摇25次或机械振荡器中振摇。制成1：10的样品稀释液备用。